Разработка и валидация методики количественного определения силденафила и n-десметил силденафила с помощью ВЭЖХ-МС/МС в плазме крови человека

Анотація

Цель. Для изучения биоэквивалентности таблетированной формы силденафила (таблетки «Тегрум» 100 мг), производства ООО «НПФ «Микрохим» (г. Рубежное, Украина) был разработан и валидирован быстрый, простой и специфический метод количественного определения концентрации силденафила и его активного метаболита - N-десметил силденафила в плазме крови человека с применением внутренних стандартов, меченных атомами дейтерия. Извлечение аналитов из плазмы крови выполнялось методом прямой жидкость-жидкостной экстракции.

Методы. Содержание силденафила и его десметилированного метаболита определяли в надосадочной жидкости методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием. Ионизацию cилденафила, N-десметил силденафила, cилденафила-d8 и N-десметил силденафила-d8 проводили электрораспылением в положительном режиме (ESI, Positive). При детектировании использовали мониторинг мультиреакций (MRM) выбранных материнских ионов с m/z 475,30; 483,20; 461,20; 469,20. Дочерний ион был выбран с m/z 283,10 для всех анализируемых соединений.

Результаты. В ходе валидации данного метода в линейном диапазоне 5,05-1009,92 нг/мл для силденафила и 2,24-400,84 нг/мл для N-десметил силденафила коэффициент корреляции (r²) составил 0,9975 и 0,9973 соответственно, также была продемонстрирована надёжная правильность и воспроизводимость результатов для обеих аналитов.

Выводы. Разработан и валидирован простой, специфический и чувствительный ВЭЖХ-МС/МС метод количественного определения концентрации силденафила и его активного метаболита N-десметил силденафила в плазме крови человека с применением меченных стабильными изотопами внутренних стандартов - силденафил-d8 и N-десметил силденафил- d8. Разработанный нами экспресс-метод подготовки биологических образцов, позволяет исключить влияние биологической матрицы на получаемые результаты и определять низкие концентрации обоих аналитов в надосадочной жидкости без применения таких трудоемких и времязатратных процедур, как концентрирование пробы, восстановление сухого остатка или дорогостоящей твердофазной экстракции. Экспериментальные данные, полученные в ходе полной валидации метода, соответствуют установленным национальным и международным требованиям, а так же подтверждают высокую специфичность, чувствительность, точность, воспроизводимость и экономичность разработанного нами метода.