Використання тест-систем для оцінки загальної антиоксидантної активності насіння

Автор(и)

  • В. В. Поздняков Інститут рослинництва ім. В.Я. Юр`єва НААН, Україна
  • А. А. Василенко Інститут рослинництва ім. В.Я. Юр`єва НААН, Україна

DOI:

https://doi.org/10.30835/2413-7510.2017.120443

Ключові слова:

антиоксидант, загальна антиоксидантна здатність, тест-система, DPPH•, етап проведення аналізу

Анотація

Вступ. Метод DPPH•(з використанням вільного радикалу), є одним з розповсюджених непрямих методів оцінки загальної атиоксидантної активності (ЗАА). DPPH• не реагує з флавоноїдами, які не містять гідроксильних груп у В-кільці, а також з ароматичними кислотами, що містять тільки одну гідроксильну групу. Метод базується на властивості стабільного радикалу 2,2-дифеніл-1-пікрлгідразілу (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl – DPPH•) реагувати з донорами протонів, включно з фенолами.

Основна мета роботи полягала в апробації тест-системи DPPH• для проведення оцінки ЗАА насіння при масовому аналізі (проведення скрінінгу генофонду України і селекційного матеріалу).

Обговорення результатів. Визначення антирадикальної активності проводять з використанням стабільного радикалу (DPPH•) у відповіднсті до методики, представленоїS.Arabshahi, A.Urooj (2007), але з деякими змінами: метиловий спирт векстрагуючому розчині було замінено на нетоксичний етиловий; концентраціюDPPH• було обрано таким чином, щоб максимальна екстинція розчину не превищувала 1,4 од. та світлопроникність всіх розчинів знаходилась у межах лінійного участку калібрувального графіка. Час реакції було збільшено з 30 хв. до 2 годин, для зменшення впливу коливань температури в приміщенні лабораторії (від + 13°С до + 30°С) та збільшення кількості зразків, що аналізували в одному досліді, до 32 (у трьох повтореннях).

У результаті проведених чисельних експериментів було прийнято наступний хід проведення аналізів. Насіння додатково підсушують у термостаті при 25 °С впродовж 4–5 діб. Зразок розмелюють на лабораторному млиночку впродовж 1 хв. (3× 20 сек). Борошно, наважкою 0,5 г, кладуть у віали (з кришками, які герметично закриваються), заливають 4,5 мл 80% розчином етанолу в дистильованій воді і екстрагують 18–20 годин в темряві при кімнатній температурі. Проби центрифугують (10 хв. при 3000 × g) на ОПН-3, а потім по 2 мл надосадного розчину переносять у чисті віали. Спиртовий розчин радикалу готують наступним чином: розчинюють 22 мг DPPH•у 400 мл 80 % етанолу на магнітному розмішувачі при розсіяному світлі, а невеликі частинки барвника, що не розчинився, додатково розтирають порцеляновим товкачиком. Розчин фільтрують і зберігають впродовж дня проведення досліджень. Перед початком аналізу проводять вимірювання оптичної щільності розчину, що обув отриманий після додавання 0,5 мл
80 % розчину етанолу до 3,5 мл розчину DPPH• на спектрофотометрі при 517 нм. Якщо екстинція перевищує 1,4 од., то розчин додатково розбавляють 80 % розчином етанолу так, щоб його екстинція дорівнювала 1,4 од. (робочий розчин DPPH•, приблизно 125 мкМ). До 3,5 мл робочого розчину DPPH• додають 0,5 мл екстракту насіння при кімнатній температурі, швидко перемішують, розміщують у темному місці на 2 години і реєструють зміну світлопоглинання розчину. У контрольному зразку до 3,5 мл робочого розчину DPPH• додають 0,5 мл 80 % етанолу. Здатність зразка нейтралізувати стабільний вільний радикал DPPH• (антирадикальна активність – АА) визначали як: АА=(A−B)/A×100%, де А – світлопоглинання контрольного зразка, В – світлопоглинання робочого зразка (через 2 години після змішування з робочим розчином радикалу DPPH•). В якості стандарту антиоксидантної активності використовували хлорогенову кислоту і ЗАА передавали в мг хлорогенової кислоти на 1 г зразка. В випадку проведення аналізу ЗАА насіння зернових з дуже високими значеннями цього показника, необхідним є зменшення кількості екстракту що додається до розчину DPPH•, наприклад, 0,2 мл. В цьому випадку необхідно зробити новий калібровочний графік стандарту.

Висновки. За останні роки спрямованість використання методів установлення антиоксидантної активності поступово виходить в бік розробки і використання простих і не вартісних методів оцінки великої кількості біологічних зразків. Це викликано не тільки зростаючою цікавістю як спеціалістів харчової промисловості, так і дієтологів до пошуку нових джерел цінних продуктів харчування, але й необхідністю проведення скринінгу рослинного генофонду з метою виділення найбільш перспективних зразків для біофортифікації

Посилання

Halliwell B. Antioxidants: the basics – what they are and how to evaluate them.Adv. Pharmacol. 1997; 38:3–20.

Huang D, Ou B, Prior RL. The chemistry behind antioxidant capacity assays. J. Agric. Food Chem. 2005; 53: 1841−1856.

Prior RL,Wu X, SchaichK.Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements.J. Agric. Food Chem. 2005; 53(10): 4290–4302.

Číž M, Čížova H, Denev P, Kratchanova M, Slavov A, Lojek A. Different methods for control and comparison of the antioxidant propertiesof vegetables.Food Control. 2010; 21: 518–523.

Aruoma OI. Methodological considerations for characterizing potential antioxidant actions of bioactive components in plant foods. Mutation Research. 2003; 523–524: 9–20.

Schlesier K, Harwat M, Bohm V, Bitsch R. Assessment of Antioxidant Activity by Using Different In Vitro Methods. Free Rad. Res. 2002; 36(2): 177–187.

Davies KJA. Oxidative stress, antioxidant defenses, and damage removal,repair, and replacement systems. IUBM Life. 2000;50(4–5): 279–289.

Prior RL,Hoang H, Gu LW, Wu X, Bacchiocca M, Howard L, Hampsch-Woodill M, Huang D, Ou B, JacobR.Assays for hydrophilic and lipophilic antioxidant capacity (oxygen radicalabsorbance capacity (ORACFL) of plasma and other biological and food samples.J. Agric. Food Chem. 2003; 51(11):3273–3279.

Serrano J, Goñi I, Saura-Calixto F. Food antioxidant capacity determined by chemical methods may underestimate the physiological antioxidant capacity. Food Res. Int. 2007; 40: 15–21.

Roginsky V, Lissi EA. Review of methods to determine chain-breaking antioxidant activity in food. FoodChemistry. 2005; 92: 235–254.

Khasanov VV, Ryzhova GL, Maltseva ЕV. Methods of antioxidant studies. Khimiya rastitelnogo syryia. 2004; 3: 63–75.

Beltyukova SV, Stepanova AA, Liventsova ЕО. Antioxidants in food products and methods for their determination. Visnyk ONU. Khimiia. 19(4-52): 16–31.

Sazhina NN. Determination of antioxidant activity of differentbioactioxidants and their mixtures by amperometry. Khimiya rastitelnogo syryia. 2016; 4: 71–76.

Cao G, Alessio HM, Cutler RG. Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants. Free Rad. Biol. Med. 1993; 14: 303−311.

Pellegrini N, Re R, Yang M, Rice-EvansС. Screening of dietarycarotenoids and carotenoid-rich fruit extracts for antioxidant activities applyingthe 2,20-azinobis(3-ethylenebenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) radical cationdecolorization assay. Methods in Enzymology. 1999; 299: 379–389.

Benzie IFF, Strain JJ. Ferric reducing antioxidant power assay: Directmeasure of total antioxidant function of biological fluids and modified versionfor simultaneous measurement of total antioxidant power and ascorbic acidconcentration.Methods in Enzymology, Oxidants and Antioxidants. 1999;299:15−27.

Ghiselli AA,Serafini M, MaianiG, Azzini E, Ferro-Luzzi A. Аfluorescence-based method for measuring total plasma antioxidant capability.FreeRad. Biol. Med.1995; 18(1): 29–36.

Burlakova EB, Alesenko AV, Molochkina EM, Palmina NP, Khrapova NG. Bioantioxidants in radiation injury and malignant growth.Мoscow: Nauka, 1975.214 p.

TirzitisG,Bartosz G.Determinationofantiradicalandantioxidantactivity: basicprinciplesandnewinsights. Acta Biochimica Polonica. 2010; 57: 139–142.

Berker KI, Guclu K, Demirata B, Apak R. A novel antioxidant assay of ferric reducing capacity measurement using ferrozine as the colour forming complexation reagent. Anal. Methods. 2010; 2: 1770–1778.

Apak R, Gorinstein S, Böhm V, Schaich KM, Özyürek M., Güçlü K. Methods of measurement and evaluation of natural antioxidant capacity/activity (IUPAC Technical Report). Pure Appl. Chem.2013; 85(5):957–998.

Von Gadov A, Joubert E, Hansmann СF. Comparison of the antioxidant activity of aspalathin with that of other plant phenols of Roobies tea (Aspalathus linearis), α-tocopherol, BHT, and BHA. J. Agric. Food Chem. 1997; 45: 632–638.

ArabshahiS,Urooj A.AntioxidantpropertiesofvarioussolventextractsofMulberryMorusindicaL. Leaves. Food Chem. 2007; 102: 1233–1240.

Bonoli M, Verardo V, Marconi E, Caboni MF. Antioxidant phenols in barley (Hordeum vulgare L.) flour: comparative spectrophotometric study among extraction methods of free and bound phenolic compounds. J. Agric. Food Chem. 2004; 52:5195–5200.

ZhouK, Yu L. Effectsofextractionsolventonwheatbranantioxidantactivityestimation.Lebensm.-Wiss. u.-Technol. 2004;37:717−721.

Huang HY, Caballero B, Chang S,Alberg A, Semba R, Schneyer C, Wilson RF, Cheng TY, Prokopowicz G, Barnes GJ 2nd, Vassy J, Bass EB. Multivitamin/mineral supplements and preventionof chronic disease. Evid. Rep. Technol. Assess. 2006; 139:1–117.

##submission.downloads##

Опубліковано

2018-01-03

Номер

Розділ

ФІЗІОЛОГО–ГЕНЕТИЧНІ ТА БІОХІМІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ