Закономірності первинного росту Blastocystis sp.  на п’яти типах живильних середовищ

Сергій Похил; Олена Тимченко; Ніла  Чигиринська; Ірина  Костиря; Ігор Бодня; Вікторія Кальян

Автор(и)

Сергій Похил Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of the National Academy of Medical Sciences of Ukrain, Україна
Олена Тимченко State Institution " I. Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology National Academy of Medical Sciences of Ukraine". microbo, Україна
Ніла Чигиринська Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of the National Academy of Medical Sciences of Ukrain, Україна
Ірина Костиря Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine , Україна
Ігор Бодня Kharkiv National Medical University of the Ministry of Health of Ukraine, Україна
Вікторія Кальян Kharkiv National Medical University of the Ministry of Health of Ukraine, Україна

Анотація

Анотація. Blastocystis sp. є найпоширенішим протозойним паразитом інтестинального тракту людей і багатьох тварин. Збиткова колонізація Blastocystis sp. кишечнику у людей асоціюється із розвитком різних запальних захворювань та синдрому подразненого кишечнику (СПК), які можуть супроводжуватись алергічними реакціями. У теперішній час для виявлення Blastocystis sp. у зразках фекалій використовують мікроскопічні, культуральні (вирощування паразитів in vitro), імунологічні та молекулярно-генетичні методи. Культуральні методи характеризуються високими рівнями чутливості та специфічності, вони широко застосовуються при проведенні епідеміологічних досліджень поширеності Blastocystis sp., для визначення чутливості цих найпростіших до лікарських препаратів, отримання антигенів паразитів, вивчення патогенезу бластоцистозу та вірулентного потенціалу штамів збудника різного походження, у тому числі - інтенсивності утворення амебоїдних морфоформ, які мікроскопічними методами відносно рідко вдається виявити безпосередньо у ЗФ. Переважна більшість попередніх досліджень особливостей in vitro росту Blastocystis sp. на різних середовищах виконано із використанням аксенічних та стабілізованих ксенічних культур паразитів. Метою цієї роботи було з’ясування закономірностей росту первинних культур Blastocystis sp. на п’яти типах живильних середовищ та визначення найбільш ефективних серед них для виявлення амемоїдних морфоформ у короткострокових культурах паразитів. Матеріали та методи. Посівним матеріалом слугували три свіжі ЗФ від хворих із СПК-Д (Рим IV), які містили ≥ 5 клітин Blastocystis sp. у полі зору при світловій мікроскопії із збільшенням ×400. Ідентифікацію Blastocystis sp. здійснено за результатом мікроскопії мазків фекалій, стійко забарвлених трихромом за модифікацією Вітлі та залізним гематоксиліном за Гендейгайном. Посівна доза гомогенату ЗФ (розведення 1:10 у ФСБ pH=7,4 становила 200 мкл на кожну пробірку із 5 мл рідких середовищ Jones’s (mJones’s), RPMI-1640 (RPMI), Iscove's modified DMEM (IMDMEM), RPMI/IMDMEM (суміш рівних об’ємів середовищ RPMI і IMDMEM) та рідкої фази модифікованого двофазного середовища LE (mLE, модифікація Бока і Дрбохлава. Усі типи середовищ містили антибіотики (ампіцилін 12 мг/мл і стрептоміцин 4 мг/мл) та 10 % інактивованої сироватки коня. Вирощування культур Blastocystis sp. проводили в анаеробних умовах при 37 ^оС упродовж 10 діб. Закономірності первинного росту Blastocystis sp. на п’яти типах середовищ охарактеризовано за показниками: часу генерації клітин паразитів (Т_g) у годинах (год); максимальної концентрації життєздатних клітин Blastocystis sp. (MCVC) у мілілітрі (мл); часу у днях, необхідного для досягнення MCVC у культурах паразитів (PTD); збереження характерних фенотипічних ознак у клітин Blastocystis sp. різних форм (CPFC); відносної кількості у відсотках амебоїдних форм у культурах паразитів (PAF); придатності для тривалого субкультивування Blastocystis sp. (SLTS). Визначення показників Т_g, MCVC і PTD ґрунтувалось на результатах підрахунку кількості життєздатних клітин Blastocystis sp. у мікрооб’ємах їх культур. Кількість життєздатних клітин Blastocystis sp. в усіх пробірках визначали відразу після висіву ГЗФ та щодобово упродовж періоду культивування. Підрахунок клітин Blastocystis sp. проводили в гемоцитометрі із застосуванням тесту на виключення барвника трипанового синього. Показник CPFC оцінено за результатом фазово-контрастної мікроскопії суспензій Blastocystis sp. із збільшенням ×600). Величину показника PAF для кожного типу середовища визначено шляхом розрахунку % амебоїдних фоформ серед 300 підрахованих клітин паразитів у мазках суспензій, стійко забарвлених модифікованим методом за Філдом. Значення показника SLTS встановлено за результатом підтримки росту субкультур Blastocystis sp. упродовж 10 послідовних їх пасажів на однотипних середовищах. Результати та обговорення. Впродовж першої доби вирощування (фаза адаптації і початку росту) на усіх типах середовищ Тg був відносно найдовшим (р<0,05), його середнє значення становило (27,9±5,7) год, (23,5±3,9) год, (20,4±4,6) год, (28,3±6,0) год і (23,2±4,1) год на mJones’s, mLE, RPMI, IMDMEM та RPMI/IMDMEM, відповідно. З другої доби культивування до часу досягнення максимальної концентрації клітин Blastocystis sp. у суспензіях (фаза експоненціального росту) Тg скорочувався до досягнення мінімальних значень на вказаних середовищах відповідно: (19,5±3,0) год, (18,9±4,6) год, (17,8±2,5) год, (22,3±4,7) год та (18,5±3,8) год. На подальших етапах культивування Blastocystis sp. (фази стаціонарного росту і початку прискореної загибелі клітин) величина показника Тg знову дещо зростала, але до завершення терміну спостереження на десяту добу не досягала значень фази адаптації і початку росту. Встановлено, що при in vitro вирощуванні автентичних за походженням культур Blastocystis sp. на різних типах середовищ величина показника MCVC може істотно різнитись (р<0,05). Для використаних в експериментах штамів паразитів середнє значення MCVC сягало: (25,5±6,7)×10⁵ клітин/мл, (32,0±7,8)×10⁵ клітин/мл, (56,6±9,0)×10⁵ клітин/мл, (36,6±8,4)×10⁵ клітин/мл і (50,1±9,4)×10⁵ клітин/мл на середовищах mJones’s, mLE, RPMI, IMDMEM та RPMI/IMDMEM відповідно. При цьому, PTD становить 3 дні на середовищах mLE і RPMI, 4 дні на - mJones’s та RPMI/IMDMEM і 5 днів – на IMDMEM. На усіх типах середовищ у культурах Blastocystis sp. виявлено широкий спектр їх морфологічних форм: вакуолярні, гранулярні, амебоїдні, у стадії поділу, полівакуолярні, авакуолярні, прецисти, цисти та інші. Переважна більшість візуалізованих у суспензіях клітин паразитів характеризувались чітко вираженими ідентифікаційними ознаками, притаманними певним морфоформам цих протозойних організмів. Таким чином, за показником CPFC середовища mJones’s, mLE, RPMI, IMDMEM та RPMI/IMDMEM є цілком придатними для культивування клінічних штамів Blastocystis sp. та з’ясування закономірностей динаміки зміни морфоформ паразитів у різні терміни росту культур. Амебоїдні форми є етапом життєвого циклу Blastocystis sp. і відіграють патофізіологічну роль у виникненні та перебігу бластоцистозу. Амебоїдні клітини Blastocystis sp. досить складно ідентифікувати мікроскопічними методами безпосередньо у ЗФ, натомість вони легко виявляються при вирощуванні паразитів in vitro. Результати наших досліджень показали істотний впливу типу середовища на інтенсивність генерації амебоїдних клітин одними і тими ж самими штамами Blastocystis sp. (р < 0,05) У цілому показник PAF досягав максимально значення на наступну або через добу після дня досягнення в культурах MCVC: (8,5±4,7) %, (14,2±3,8) %, (14,9±4,4) %, (17,8±5,5) % і (19,8±5,4) % на mJones’s, mLE, RPMI, IMDMEM та RPMI/IMDMEM відповідно. Останні чотири типи середовищ виявились найбільш придатними для тривалого субкультивування штамів Blastocystis sp. (SLTS = 30). Заключення. З’ясовані закономірності первинного росту трьох культур Blastocystis sp. і їх тривалого субкультивування на середовищах mJones’s, mLE, RPMI, IMDMEM та RPMI/IMDMEM обґрунтовують доцільність підбору оптимального типу середовища з урахуванням мети і завдань передбачуваного дослідження.