Визначення аристолохієвої кислоти І у густому екстракті з трави хвилівнику звичайного методом ВЕРХ та встановлення його цитотоксичної активності

Анотація

Вступ. Хвилівник звичайний (Aristolochia clematitis L.) – багаторічна трав’яниста рослина з коротким кореневищем і характерним запахом. У різних країнах світу, зокрема в Україні, ця рослина вирощується як декоративна або зустрічається як бур’ян. Хімічний склад сировини хвилівнику звичайного представлений різними класами біологічно активних речовин, зокрема аристолохієвими кислотами. Аристолохієва кислота I – найпоширеніша аристолохієва кислота, виявлена майже в усіх видах роду Хвилівник, зокрема у хвилівнику звичайному. Відомо, що сировина хвилівнику звичайного є токсичною, зокрема завдяки вмісту аристолохієвих кислот. Дослідженнями, проведеними різними науковцями, встановлено, що аристолохієві кислоти можуть викликати нефропатію та інгібувати синтез ДНК у клітинах HepG2 гепатоми у дозозалежний спосіб. Тому, продовжуючи дослідження щодо перспективності використання сировини цієї рослини у медицині, нами було одержано густий екстракт з трави хвилівнику звичайного. Метою роботи було визначення аристолохієвої кислоти І у густому екстракті з трави хвилівнику звичайного та визначення його цитотоксичної активності. Матеріали та методи. Для дослідження використовували густий екстракт, одержаний з трави хвилівнику звичайного, заготовленої у період цвітіння. Технологія одержання густого екстракту з трави хвилівнику звичайного така: наважку здрібненої на порошок сировини вміщували в конічну колбу і додавали як екстрагент 70 % етанол. Спочатку настоювали протягом 1 години при кімнатній температурі, потім нагрівали зі зворотнім холодильником протягом 2 годин при температурі 60°С. Далі одержану витяжку охолоджували, фільтрували та висушували до отримання густого екстракту. Хроматографічне вивчення густого екстракту з трави хвилівнику звичайного проводили на рідинному хроматографі, обладнаному діодноматричним детектором Shimadzu HPLC-system, ser.20 в таких умовах: колонка Xterra MS C18, розміром 150 мм х 4,6 мм, розмір частинок 3,5 мкм; температура колонки – 40С; довжина хвилі детектування – 390 нм; швидкість потоку рухомої фази – 0,3 мл/хв; об'єм проби, що вводився – 25 мкл; ¹  Елюент A: 0,1 % водний розчин трифтороцтової кислоти. ² Елюент B: 0,1 % розчин ацетонітрилу в трифтороцтовій кислоті. Суміш розчинників: ацетонітрил – вода (50:50). Розчин порівняння: наважку стандартного зразка аристолохієвої кислоти І 1 мг розчиняли в суміші розчинників і доводили до позначки тим самим розчиннком. 1 мл отриманого розчину переносили в колбу на 10 мл і доводили сумішшю розчинників до позначки. Розчин фільтрували через фільтр 0,45 мкм. Визначення цитотоксичної активності проводили на моделі in vitro у Національному фармацевтичному університеті, на базі проблемної лабораторії морфофункціональних досліджень, під керівництвом д.біол.н., професора Малоштан Л.М. У дослідженні використано лінію перещеплюваних культур клітин тварин ВНК-21 (Baby Hamster Kidney) – культура клітин фібробластоподібного типу нирки новонародженого сирійського хом'яка. Цитотоксичний вплив оцінювали по зниженню проліферації клітин в тесті з генціанфіолетом. Результати та обговорення.  У ході проведення аналізу в одержаному екстракті було ідентифіковано аристолохієву кислоту I (час утримування – 5,766±0,018 хв). Час утримування стандартного зразку аристолохієвої кислоти I – 5,847±0,022 хв. Вміст аристолохієвої кислоти I у досліджуваному екстракті становив 0,39±0,01 %. У результаті визначення цитотоксичної активності густого екстракту з трави хвилівнику звичайного встановлено, що найвиразніші показники цитотоксичного впливу були зареєстровані в дозі 15-60 мг/мл після інкубації протягом 24 годин. На фоні доз 60 мг/мл відмічений практично 98%-вий цитотоксичний ефект. LC₅₀ була зареєстрована на тлі дози 7,5 мг/мл після інкубування з клітинами BHK-21 протягом 24 годин. На фоні доз 3,75 мг/мл та 1,85 мг/мл зареєстрована приблизно однакова кількість клітин, які вижили, яка складала 75,0% та 74,88% відповідно. В експозиції 48 годин під впливом екстракту відзначено підвищення цитотоксичної дії. Висновки.  У результаті проведеного дослідження у густому екстракті з трави хвилівнику звичайного ідентифіковано аристолохієву кислоту І, а також визначено її кількісний вміст, який становив 0,39 %. За допомогою фотоколориметричного методу було встановлено цитотоксичну дію досліджуваного густого екстракту трави хвилівнику звичайного на клітини BHK-21. Визначення ступеня проліферації клітин BHK-21 у тесті з генціанфіолетом показало, що здатність до проліферації в присутності досліджуваного екстракту носила дозо- і час-залежний характер. Таким чином, отримані дані можуть бути використані при стандартизації густого екстракту з трави хвилівнику звичайного, а також при розробці та одержані нових лікарських засобів на основі одержаного екстракту.

Ключові слова: Aristolochia clematitis, аристолохієва кислота I, ВЕРХ, цитотоксична активність.

DOI: 10.5281/zenodo.6350303