Діагностична перспективність оцінки вірулентного потенціалу штамів Blastocystis sp. за показниками рівнів утворення амебоїдних форм та протеазної активності

Анотація

Вступ. Бластоцисти - одноклітинні анаеробні еукаріотичні найпростіші, які колонізують кишечник багатьох видів тварин і людини та викликають патологічні зміни з низкою неспецифічних симптомів — абдомінальний біль, діарея, метеоризм, анорексія, нудота, блювання, анальний свербіж, неконтрольована вага. втрата. Поєднання двох критеріїв – виявлення ≥ 5 клітин Blastocystis sp. при світловій мікроскопії із збільшенням × 400 та виключенням ролі інших збудників сьогодні використовується для діагностики бластоцистозу. Останнім часом дослідження потенціалу вірулентності дало багато нових результатів. Методи визначення кількості амебоїдних форм і вимірювання протеазної активності лізатів прості й перспективні. Метою цього дослідження було експериментальне обґрунтування визначення рівня вірулентного потенціалу Blastocystis sp. штамів з використанням показників відсотка утворення амебоїдних форм (PAF) у культурі in vitro та рівня протеазної активності (Pa) лізатів. Матеріали та методи. 12 штамів Blastocystis sp. були отримано із зразків фекалій (ЗФ) різного походження, які були 3 від безсимптомних і 9 від симптомних пацієнтів. Паразитарне навантаження нативних  ЗФ визначали за допомогою світлової мікроскопії їх мокрих мазків (збільшення × 400, 1% розчин Люголя) (середня кількість клітин у 10 полях зору). 200 мкл нативних свіжих фекалій зассіювали у 5 мл рідкого середовища RPMI/IMDMEM із сироваткою та антибіотиками. Вирощування культурBlastocystis sp.  проводили в анаеробних умовах при 37 ^оС протягом 5 діб (для визначення PAF); і 10 послідовних пасажів проводили у цьому середовищі для стабілізації культур (для  визначення Ра). Значення індексу PAF для кожного штаму визначали шляхом розрахунку процентного вмісту амебоїдних форм у 300 підрахованих клітинах паразитів у суспензійних мазках, пофарбованих за Філдом в модифікації. Показник Рa визначали за в сспензіях 4-денних стабілізованих культур бластоцист. Клітини тричі осаджували при 500 g протягом 5 хв і промивали ФСБ. Гістопак (1,077 г/мл) використовували для остаточного очищення (5000 g 10 хв). Необхідну концентрацію 1×10⁶ клітин/мл визначали за допомогою гемоцитометра з додаванням  ФСБ. Ми використали 15 циклів заморожування та розморожування для виведення протеаз із клітин. Для визначення протеазної активності лізатів Blastocystis sp. використовували біохімічний метод розщеплення азоказеїну за допомогою колорометричного аналізу (LisaScan EM, λ=450 нм). Результати та обговорення. Амебоїдні форми бластоцист виявлено у 8 із 12 (66,7%) вирощених культур, що перевищує показник прямої копроскопії (p≤0,05). Найнижчі рівні PAF (1,7-2,3%) були виявлені у штамів, які мали низьку концентрацію паразитів у зразках калу. Штами  двох груп пацієнтів із низьким паразитарним навантаженням у фекаліях мали низький рівень Ра (<20 AU). І навпаки, штами від осіб із симптомами та помірною чи високою кількістю паразитів (відповідно 2,5-3,8 та ≥ 5 на поле) мали рівні Pa > 30 AU, що є ознакою вірулентності. Незважаючи на те, що генерація амебоїдних форм корелює з патогенністю паразитів, слід враховувати, що індекс PAF залежить від типу поживних середовищ. Відзначено сильний позитивний кореляційний зв’язок між значеннями PAF  та значеннями Pa у штамів: у культурах з PAF < 3 % значення Pa < 20 AU, а у паразитів з PAF > 10 % рівень Pa > 30 AU. Висновки. Штами Blastocystis sp. від осіб із симптомами та помірним або важким паразитарним навантаженням на зразки фекалій мали вищі значення PAF та Pa (p ≤ 0,05)в культурі. Оцінку вірулентного потенціалу з визначенням PAF  in vitro ми рекомендуємо проводити за таких умов: підозра на бластоцистоз, амебоїдні форми відсутні, але інші морфоформи присутні в середніх концентраціях у мазках нативних фекалій. Ознаки вірулентності штамів бластоцисти слід розглядати за умови - PAF > 10% і Pa > 30 AU.

Ключові слова: Blastocystis sp., протеазна активність, амебоїдні форми, in vitro.